Q1：DNA Pull Down的原理是什么？

A：DNA Pull Down是根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)DNA探針并進(jìn)行生物素標(biāo)記，標(biāo)記的探針結(jié)合到鏈霉親和素修飾的磁珠上，形成磁珠-探針復(fù)合體。將磁珠-探針復(fù)合體與提取的蛋白孵育，鑒定與DNA探針有特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

Q2：探針的設(shè)計(jì)原則是什么，長度為多少個(gè)堿基比較合適？

A：啟動(dòng)子的長度一般為100-1000 bp，我們建議選擇起始密碼子上游1000 bp的序列，根據(jù)這1000 bp的序列，來設(shè)計(jì)DNA探針。我們建議探針長度在100 bp-500 bp之間，如果探針序列太短，會(huì)降低與蛋白的親和能力；反之，如果探針序列太長，則會(huì)增加非特異性結(jié)合。

Q3：做DNA Pull Down的探針，用單鏈好還是用雙鏈好？

A：轉(zhuǎn)錄因子是與啟動(dòng)子區(qū)特定的motif結(jié)合，DNA雙鏈的正義鏈和反義鏈上都可能會(huì)有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合依賴于氫鍵和范德華力，雙鏈DNA能夠增加轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力。

Q4：一般會(huì)找到多少個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，成功率是多少，有沒有成功的案例？

A：由于DNA Pull Down的特異性強(qiáng)，假陽性率低，根據(jù)我們的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，一條DNA探針能夠結(jié)合1-6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。我們目前所做的項(xiàng)目，成功率為80%。我們鑒定出了作物、花卉和木本植物的WRKY、MYB、HD-ZIP、MADS、HSF等轉(zhuǎn)錄因子。

Q5：本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在哪里，影響DNA Dull Down實(shí)驗(yàn)的因素有哪些？

A：由于樣本的種類多種多樣，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)豐度低，本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于樣本細(xì)胞核的分離、細(xì)胞核蛋白的提取。影響DNA Dull Down實(shí)驗(yàn)的因素主要有蛋白的表達(dá)豐度、蛋白和DNA結(jié)合的強(qiáng)弱程度等。

Q6：SDS PAGE之后，為什么用銀染，而不是考染？

A：由于提取或洗脫的蛋白豐度低，所以使用銀染進(jìn)行SDS PAGE后的染色，銀染檢測(cè)靈敏度高，能夠檢測(cè)到ng級(jí)的蛋白質(zhì)。通過銀染，也能夠判斷蛋白提取的質(zhì)量，以及Pull Down之后蛋白洗脫的效果。

Q7：為什么實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組也能夠鑒定出蛋白？

A：如果物種蛋白數(shù)據(jù)庫完整度低、肽段注釋質(zhì)量差，則需要進(jìn)行全庫搜索。全庫搜索，對(duì)于負(fù)對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組來說，往往有非特異性蛋白或肽段。這是因?yàn)橛幸恍┑鞍啄軌蚺c磁珠非特異性結(jié)合；另外，配制實(shí)驗(yàn)緩沖液所用的原料試劑、在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)有外部環(huán)境蛋白的污染，比如人的角蛋白污染。由于質(zhì)譜鑒定的靈敏度很高，即使有痕量的蛋白污染，也會(huì)被檢測(cè)出來。

Q8：后續(xù)的驗(yàn)證可以選擇哪些實(shí)驗(yàn)？

A：后續(xù)可以使用酵母單雜交、EMSA、LUC等實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步驗(yàn)證。