2025年9月9日，浙江大學(xué)汪俏梅教授團(tuán)隊在Plant Communications （IF: 11.6）上在線發(fā)表了題為SlBES1-mediated brassinosteroid signaling suppresses flavonoid biosynthesis in tomato fruit的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)鑒定了SlBES1及其同源基因SlBZR1的全基因組靶基因，揭示其對番茄果實類黃酮合成的調(diào)控作用及機(jī)制，為番茄品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。

文章主要內(nèi)容

研究背景

番茄（Solanum lycopersicum）是一種重要的蔬菜作物，其果實色澤和營養(yǎng)價值備受關(guān)注。果實顏色主要由果肉的類胡蘿卜素和果皮的黃酮類物質(zhì)共同決定。但由于現(xiàn)代栽培番茄的黃酮含量普遍較低，且兼具植物抗逆（紫外防護(hù)、抗生物脅迫）與人類健康益處（抗氧化、抗炎），因此類黃酮被視為評估番茄果皮顏色和營養(yǎng)價值的核心指標(biāo)。目前雖然已知類黃酮合成通路及BR信號通路，但BR調(diào)控番茄類黃酮合成的分子機(jī)制仍不清楚。

主要研究結(jié)果

1、BR抑制類黃酮合成

本研究通過外源EBL處理番茄果實，結(jié)合高效液相色譜（HPLC）檢測果實表皮類黃酮（以NarCh為指標(biāo)）含量及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測類黃酮相關(guān)基因（SlMYB12、SlCHS1、SlCHS2、SlF3'H）表達(dá)，結(jié)果顯示外源EBL處理能顯著抑制番茄果皮類黃酮的積累。然后進(jìn)一步構(gòu)建了BR生物合成限速酶基因SlCYP90B3的過表達(dá)和RNA干擾系進(jìn)行驗證，結(jié)果表明內(nèi)源BR通過SlCYP90B3負(fù)調(diào)控類黃酮合成。

圖1 EBL對類黃酮生物合成的影響

2、BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分參與調(diào)控類黃酮的生物合成

BZR轉(zhuǎn)錄因子在油菜素內(nèi)酯（BR）信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中SlBES1和SlBZR1是具有正向調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄因子。為進(jìn)一步明確SlBES1和SlBZR1在類黃酮生物合成中的功能，研究團(tuán)隊構(gòu)建了SlBZR1和SlBES1的過表達(dá)株系（SlBES1-OE和SlBZR1-OE），單基因敲除突變體（bes1、bzr1）及雙基因敲除突變體（bzr1 bes1）。結(jié)果表明，與野生型相比，SlBES1-OE果實類黃酮含量顯著降低，類黃酮相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)；bes1及bzr1 bes1果實類黃酮含量顯著升高，相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)，且雙突變體效果強(qiáng)于bes1單突變體；而SlBZR1-OE與bzr1的類黃酮含量無明顯差異，表明SlBES1在類黃酮合成調(diào)控中起主導(dǎo)作用。采用相同方法，構(gòu)建SlBIN2-OE與CRISPR/Cas9 敲除（bin2）材料，結(jié)果表明SlBIN2正調(diào)控番茄果實類黃酮合成，與SlBES1的負(fù)調(diào)控作用相反。

圖2 SlBES1負(fù)調(diào)控類黃酮的生物合成

3、SlBES1直接結(jié)合并抑制類黃酮合成基因表達(dá)

為解析SlBES1抑制類黃酮生物合成的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊克隆了類黃酮生物合成相關(guān)基因SlCHS1、SlCHS2和SlF3'H的啟動子序列。Y1H、ChIP-qPCR和Dual-luc實驗結(jié)果表明，SlBES1可與類黃酮合成基因啟動子結(jié)合抑制類黃酮合成基因的轉(zhuǎn)錄。

圖3：SlBES1直接結(jié)合并抑制proSlCHS1、proSlCHS2和proSlF3’H的表達(dá)

4、SlMYB12介導(dǎo)SlBES1的層級轉(zhuǎn)錄調(diào)控

通過對紅果番茄品種（SlMYB12功能正常）和粉果番茄品種（SlMYB12功能缺陷）的MG期果實施加EBL，發(fā)現(xiàn)BR對類黃酮合成的調(diào)控依賴SlMYB12。進(jìn)一步Y1H、ChIP-qPCR及雙熒光素酶實驗驗證，顯示SlBES1與SlMYB12啟動子的互作及調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)SlBES1可在體外和體內(nèi)直接結(jié)合SlMYB12啟動子的E-box區(qū)域，且顯著抑制SlMYB12啟動子的熒光素酶活性，表明SlBES1直接抑制SlMYB12轉(zhuǎn)錄。VIGS結(jié)果表明，在bes1背景下敲除SlMYB12可削弱bes1的高類黃酮含量表型。這些結(jié)果表明，SlBES1可以通過SlMYB12層級轉(zhuǎn)錄調(diào)控類黃酮生物合成。

圖4：SlBES1通過SlMYB12層級轉(zhuǎn)錄調(diào)控類黃酮生物合成

5、SlBZR1協(xié)同SlBES1抑制類黃酮合成

為了進(jìn)一步確定SlBES1、SlBZR1在番茄類黃酮生物合成下游基因轉(zhuǎn)錄中的作用，團(tuán)隊進(jìn)行了Dual-luc實驗。結(jié)果顯示SlBZR1單獨作用時對上述基因啟動子活性無顯著影響；而SlBES1與SlBZR1共表達(dá)時，對SlMYB12、SlCHS1、SlCHS2啟動子的抑制作用顯著強(qiáng)于SlBES1單獨作用，表明SlBZR1協(xié)同增強(qiáng)SlBES1對類黃酮合成的抑制作用。

圖5：SlBZR1協(xié)同SlBES1抑制類黃酮的生物合成

6、SlBES1與SlBZR1在類黃酮/類胡蘿卜素通路中功能分化

為了鑒定SlBES1和SlBZR1參與類胡蘿卜素和類黃酮代謝調(diào)控的直接靶點，研究團(tuán)隊通過RNA-seq和DAP-seq進(jìn)行了聯(lián)合分析并對它們的靶基因進(jìn)行了全面比較，結(jié)果表明，與野生型相比，bzr1 果實中類胡蘿卜素合成基因（如SlPSY1、PDS）表達(dá)顯著下調(diào)，而bes1及bzr1 bes1 果實中類黃酮合成基因（如SlCHS1、SlF3'H）表達(dá)顯著上調(diào)，表明SlBZR1主要正調(diào)控類胡蘿卜素合成通路，SlBES1主要負(fù)調(diào)控類黃酮合成通路，二者在番茄果實兩類主要色素代謝中功能分化。

圖6 聯(lián)合組學(xué)鑒定SlBZR1和SlBES1在調(diào)控類胡蘿卜素和類黃酮中的分工

7、SlBES1變異與番茄馴化中類黃酮合成分化相關(guān)

采用SNP分析鑒定SlBES1啟動子及SlBZR1編碼區(qū)的自然變異，結(jié)合356份番茄材料的類黃酮含量單性狀GWAS的方法，發(fā)現(xiàn)SlBES1的hap1-CA單倍型主要存在于低類黃酮含量材料中，其變異與類黃酮含量顯著關(guān)聯(lián)；而SlBZR1變異與類黃酮含量無顯著關(guān)聯(lián)，表明SlBES1變異是番茄馴化過程中類黃酮含量分化的重要遺傳因素。

圖7 BR信號調(diào)控番茄果實次生代謝和果色形成的分子機(jī)制

綜上所述，本研究闡明了SlBES1通過直接靶向類黃酮合成酶基因轉(zhuǎn)錄抑制，以及通過SlMYB12級聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控類黃酮生物合成的分子機(jī)制，同時聯(lián)合DAP-seq和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析了SlBES1及其同源基因SlBZR1在調(diào)控次生代謝和果實品質(zhì)中的精細(xì)協(xié)作和分工。為番茄果色調(diào)控和類黃酮生物強(qiáng)化提供理論基礎(chǔ)。